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Um intrazelluläre Proteine z.B. MAP-Kinase ; , die an der Signaltransduktion beteiligt sind, zu detektieren, wurden NCI-N417 Zellen 48 h vor der Stimulation in serumfreiem Medium, dem 0, 25 % BSA zugesetzt worden ist, kultiviert. Zur Stimulation wurden die Zellen direkt in Eppendorfgefäße überführt und 30 - 60 min stimuliert. Um die Zellen nach der Stimulation zu pelletieren, wurden sie zentrifugiert und mit 75 l 2x Probenpuffer versetzt. Die transfizierten CHO G16-hBRS-3 Zellen wurden in 24 well Platten ausgesät und 24 h in FCS haltigem Medium kultiviert. Zwei Stunden vor der Stimulation wurden die Zellen serumfrei gesetzt. Nachdem die Zellen 30 60 min stimuliert worden sind, wurde 100 l 2x Probenpuffer zugesetzt. 2x Probenpuffer: 1 ml 0, 5 Tris HCl, pH 6, 8 1 ml 0, Imidazol, pH 6, 8 4 ml SDS 1 ml Glycerin 0, 2 ml à-Mercaptoethanol 0, 8 ml 0, 1 % Bromphenolblau.
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